Resumen: clonación de ADN

Definición, propósito y pasos básicos de la clonación de ADN.

Puntos más importantes:

La clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace muchas copias idénticas de un fragmento de ADN, como un gen.
En un experimento típico de clonación, se inserta un gen blanco en un fragmento circular de ADN llamado plásmido.
El plásmido se introduce en bacterias mediante un proceso llamado transformación y las bacterias que contengan el plásmido se seleccionan mediante antibióticos.
Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para hacer más ADN plasmídico o, en algunos casos, se induce la expresión del gen para hacer proteína.
Introducción
Cuando escuchas la palabra "clonación" tal vez pienses en la clonación de organismos completos, como Dolly la oveja. Sin embargo, lo único que significa clonar algo es hacer una copia genéticamente exacta de ese algo. En un laboratorio de biología molecular, lo que se clona con más frecuencia es un gen u otro fragmento pequeño de ADN.
Si tu amiga la bióloga molecular dice que su "clonación" no está funcionando, es casi seguro que está hablando de copiar fragmentos de ADN, ¡no de hacer la siguiente Dolly!
Resumen de la clonación de ADN
La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés (tal vez el gen de una proteína humana médicamente importante) se inserta primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.
Diagrama que muestra la construcción de una molécula de ADN recombinante. Un fragmento circular de ADN plasmídico tiene extremos irregulares que coinciden con los de un fragmento del gen. El plásmido y el fragmento de gen se unen para producir un plásmido que contenga el gen. Este plásmido que contiene el gen es un ejemplo de ADN recombinante, una molécula de ADN ensamblada a partir de ADN de múltiples fuentes.

A continuación, se introduce el plásmido recombinante en bacterias. Se seleccionan las bacterias que contengan el plásmido y se cultivan. Al reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su descendencia, y de esta forma hacen copias del ADN que contienen.

¿Qué sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un plásmido? En algunos casos, necesitamos muchas copias de ADN para realizar experimentos o construir nuevos plásmidos. En otros casos, el fragmento de ADN codifica una proteína útil y las bacterias se utilizan como "fábricas" para producir la proteína. Por ejemplo, el gen de la insulina humana se expresa en bacterias E. coli para producir la insulina que usan los diabéticos.

Los pasos de la clonación de ADN

La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos cómo la clonación de ADN se puede utilizar para sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:

Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de restricción (que cortan el ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).
Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con antibióticos para identificar las bacterias que incorporaron el plásmido.
Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas como "fábricas" para producir la proteína. Recolectar la proteína de las bacterias y purificarla.

Revisemos con más detalle cada paso.

1. Cortar y pegar el ADN

¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? Un método habitual utiliza dos tipos de enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasa.

Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que se empatan, pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasa las une sellando los espacios en el esqueleto del ADN.

[Observa un diagrama de las enzimas de restricción y la ADN ligasa]

Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana, por ejemplo) en un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:

El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.
El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.

Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido recombinante que contenga el gen.

2. Transformación y selección bacteriana

Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos y otros tipos de ADN en bacterias, como la inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios. Durante la transformación, células bacterianas preparadas especialmente se someten a un choque (como alta temperatura) que las anima a incorporar ADN extraño.

[¿Por qué un golpe de calor hace que las bacterias tomen el ADN?]

Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos que permite a las bacterias sobrevivir en presencia de un antibiótico específico. Así, las bacterias que incorporan el plásmido pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que contenga el antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que contienen plásmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria sobreviviente dará lugar a un pequeño grupo con forma de punto, o colonia, de bacterias idénticas que contienen el mismo plásmido.

No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido adecuado. Eso es porque, durante una ligación, los fragmentos de ADN no siempre se "pegan" exactamente como queremos. Por el contrario, debemos recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una contiene el plásmido correcto. Se usan métodos como la digestión con enzimas de restricción y la PCR para revisar los plásmidos.

3. Producción de proteínas

Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido adecuado, podemos hacer crecer un gran cultivo de bacterias que contengan el plásmido. Luego le damos a las bacterias una señal química que les ordena producir la proteína blanco.

Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes cantidades de proteína. Por ejemplo, si nuestro plásmido contuviera el gen de la insulina humana, las bacterias comenzarían a transcribir el gen y traducir el ARNm para producir muchas moléculas de la proteína de la insulina humana.

[Más acerca de la expresión de genes humanos en bacterias]

Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden romperse para liberarla. Hay muchas otras proteínas y macromoléculas flotando en las bacterias además de la proteína blanco (la insulina en nuestro ejemplo). Debido a esto, la proteína blanco debe ser purificada o separada del resto del contenido de las células con técnicas bioquímicas. La proteína purificada puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina, administrarse a pacientes.

[¿Realmente es tan simple hacer insulina?]